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PERSISTENCIA DEL PINO CANARIO TRAS UNA PERTUBACIÓN DE GRAN MAGNITUD – PersPiCan

SPIP2014 – 01093

 

Las islas Canarias reúnen gran cantidad de ecosistemas y formaciones naturales singulares en el conjunto de España y Europa. Entre sus endemismos cabe destacar el pino canario, la especie forestal más importante del archipiélago y que presenta importantes singularidades dentro de las gimnospermas. Aparece en el Parque Nacional del Teide y es la especie dominante en el Parque Natural de la Corona Forestal que lo rodea y en el Parque Nacional de la Caldera de Taburiente.

Los pinares del archipiélago canario están sometidos a incendios recurrentes y, si bien el pino presenta una buena adaptación a los mismos, a través de la reproducción sexual y del rebrote, una excesiva frecuencia e intensidad de los incendios puede comprometer el futuro de estas masas. Además, como las erupciones del s. XX o la de 2011 frente a El Hierro pusieron de manifiesto, no es descartable que un evento volcánico intenso pueda afectar a corto o medio plazo a las islas, incluyendo los Parques Nacionales y arrasando las formaciones boscosas.

En este proyecto pretendemos evaluar el comportamiento de estas poblaciones de pino canario frente a una situación de estas características, facilitando la adopción de un plan de contingencia para la posterior recuperación de las masas arboladas.

El P.N. de El Teide está constituido por las coladas originadas tras las distintas erupciones de este volcán y que se extendieron por las dorsales del edificio Cañadas. Aunque la última erupción del Teide fue hace 1240 años, hasta hace relativamente poco tiempo se ha mantenido la actividad volcánica en torno al Parque Nacional (volcán de Chinyero en la dorsal de Abeque en 1909).

Por su parte, la Caldera de Taburiente es el resultado de una erupción extremadamente agresiva, cuyo colapso más reciente tuvo lugar hace c.560.000 años. En La Palma, el vulcanismo sigue activo en la zona sur, como atestigua la erupción en 1971 del volcán de Teneguía.

Resultados:

FUNCIONALIDAD DE TALLO Y RAÍZ

Figura 1. Borde de cicatrización lateral en herida de ventana

Se ha llevado a cabo un análisis anatómico del proceso de cicatrización tanto de heridas denominadas “de ventana” como de anillado completo del fuste de pino canario. Cuando la herida es profunda y llegua a afectar al xilema, la superficie de la misma queda recubierta por resina exudada a través de los canales resiníferos constitutivos. Se trata de una primera defensa eficaz frente a patógenos que podrían expandirse a través de dicha herida. Sin embargo, los pinos no son capaces de cicatrizar directamente desde la superficie de la herida, sino que deben hacerlo a partir de los bordes de la misma. En el caso de heridas de ventana (Figura 1) la conexión floemática se mantiene a ambos lados de la herida, y hemos comprobado que la cicatrización se produce fundamentalmente desde los bordes laterales.

En ramas o fustes jóvenes que aún conserven el córtex, la primera respuesta a la herida consiste en la suberización y lignificación de células de parénquima cortical, que sirve como barrera para dificultar la entrada de patógenos oportunistas. A continuación, se genera una peridermis traumática que conecta con la peridermis original y con el borde de la herida. En este borde se genera el tejido de cicatrización a través de la proliferación del cambium vascular. Numerosas divisiones anticlinales hacen que la línea cambial se curve hacia la superficie de la herida, y simultáneamente las primeras divisiones periclinales dan lugar a una proliferación centrífuga de tejido parenquimático, que desarrolla en su extremo una peridermis que conecta con la peridermis traumática cortical antes mencionada. A continuación, el cambium vascular comienza a generar xilema y floema, formando un borde de cicatrización que va creciendo directamente sobre la superficie de la herida, aunque sin conectar con ésta. El proceso puede prolongarse bastantes años, en función del tamaño de la herida y del estado fisiológico de la planta. En última instancia, ambos bordes contactan y se fusionan, volviéndose a cerrar la línea cambial. La parte ventral de este tejido cicatricial, en contacto con la superficie de la herida, presenta una gran proporción de células parenquimáticas. A diferencia de otros trabajos, no hemos detectado crecimiento de este tejido a partir del floema ni de los radios.

Figura 2. Estructuras columnares en heridas de anillado

Por el contrario, en las herida por anillado del fuste, en las que la conexión floemática entre los márgenes superior e inferior se ve interrumpida, hemos comprobado que la cicatrización se produce principalmente desde el borde superior (Figura 2). En primer lugar se aprecia cómo se hincha la parte superior cercana al borde de la herida, como resultado de la interrupción del flujo a través del floema. A continuación, se produce un crecimiento en el borde superior análogo al descrito para las heridas de ventana, y sobre este borde se forman una serie de protuberancias que terminan desarrollando unas estructuras columnares. Estas serán las que eventualmente lleguen a contactar con el borde inferior, recuperando así la conexión vascular. Más sorprendentemente, se ha observado que el parénquima axial asociado a canales resiníferos por debajo de la superficie de la herida comienza a proliferar, contribuyendo a la formación de estas columnas, y anclando el tejido de cicatrización al conjunto del xilema.

Estos resultados ponen de manifiesto que las células de la región cambial perciben la posición de la superficie del órgano, en un proceso en el que pueden intervenir señales mecánicas (presión ejercida por las células colindantes) y hormonales. En el borde de cicatrización y en las estructuras columnares, la herida provoca que la superficie exterior pueda ser percibida en distintas posiciones, generándose un tejido cicatricial anómalo donde las direcciones radiales y tangenciales pueden cambiar entre grupos de células contiguas. Este trabajo se ha traducido en la publicación de un artículo en revista científica de impacto:

Chano V, López R, Pita P, Collada C, Soto A (2015) Proliferation of axial parenchymatic xylem cells is a key step in wound closure of girdled stems in Pinus canariensis. BMC Plant Biology 15: 64.

Además, tras tratamientos de defoliación y defoliación + traumatismo realizados en años consecutivos (2015 y 2016), se han obtenido dos conjuntos de datos relacionados con la funcionalidad del tallo a partir del registro continuado de las variaciones diametrales del tronco. Es posible comparar los crecimientos radiales entre controles, árboles defoliados y árboles defoliados con herida traumática, encontrando grandes diferencias entre controles y los dos grupos experimentales en ambos años (Figura 3). Sin embargo, tanto los árboles defoliados como los defoliados con herida presentaron crecimientos similares.

Figura 3. Incremento diametral medio por grupo durante los dos años de medición. Nótese que en 2015 se tienen registros a partir de abril, y que los tratamientos se realizaron a finales de mayo de 2015 y mediados de junio de 2016.

Figura 4. Valores medios de la máxima contracción diaria (MDS) durante el periodo anterior y posterior al tratamiento en ambos años (2015 y 2016). Se observa cómo durante varias semanas los árboles tratados disminuyen su contracción pero no llega a anularse. En 2015 esta fase de contracción disminuida se ve interrumpida por unos días de tormentas intensas, en los que la contracción diametral se iguala en todos los grupos.

Por otra parte, las mediciones de variaciones diametrales permiten el cálculo de los valores de máxima contracción diaria, MDS (maximum daily shrinkage), que indican una aproximación de la deshidratación diaria debida a la evapotranspiración. Como era de esperar, tras los tratamientos se observa una disminución drástica de dicha variación, con diferencias entre los grupos tratados y los controles que se manifiestan 2 y 3 días después del tratamiento y durante 59 y 78 días en el primer periodo y segundo periodo de tratamiento respectivamente (Figura 4). En el momento en el que se forma suficiente tejido fotosintetizador por generación de nuevos brotes y biomasa foliar, las contracciones diarias crecen por la creciente evapotranspiración, con valores semejantes a los del grupo control.

Sin embargo, y a diferencia de los que cabría esperar, los valores de contracciones diarias durante el periodo de ausencia de biomasa foliar no son nulos, y los árboles presentan una oscilación diaria mínima. Estos valores podrían responder a la propia deshidratación de los tejidos del tronco por evaporación, creando un gradiente de humedad que consigue la rehidratación de estos tejidos durante la noche, o pueden deberse a procesos propios del sistema radical, influyendo en las partes más bajas del tronco donde se localizan los sensores de desplazamiento.

CONSUMO DE RESERVAS

Tras el primer tratamiento de defoliación y defoliación + traumatismo se tomaron muestras de acículas, xilema, floema y raíces en diferentes momentos a lo largo del periodo vegetativo de ese año y el inicio del siguiente, con el fin de analizar las variaciones de los carbohidratos no estructurales y de los isótopos estables del carbono (δ13C) en dichos tejidos. Los valores de carbohidratos no estructurales muestran diferencias entre tratamientos y tejidos. Respecto a los azucares solubles en agua, de rápida metabolización, no existen variaciones entre los controles y los dos tratamientos distintos. Sin embargo, en el metabolismo del almidón, un carbohidrato que no se metaboliza de una manera tan rápida y que cumple además con funciones de reserva, se encontraron diferencias notables. Como se observa en la Figura 5, los dos grupos de árboles tratados agotaron todas las reservas de almidón en el floema cuando recuperaron el crecimiento radial (tiempo 4), restableciendo dichas reservas durante el invierno. Sin embargo, en las raíces de los árboles tratados el porcentaje de almidón baja por debajo del control en el momento en el que han terminado de generar nueva masa foliar (tiempo 3), no volviendo a recuperar los valores de almidón de los controles. Además, los árboles tratados con defoliación más traumatismo presentaron agotamiento de las reservas de almidón al inicio del periodo estacional siguiente. Esto muestra que las heridas en el troco generan un uso adicional de carbohidratos para la resinación y cierre de la herida. Cabe destacar también la gran cantidad de carbohidratos de reserva que almacena esta especie en las raíces. En general, otras especies del género Pinus utilizan las acículas de años anteriores como órgano de almacenamiento, pero el pino canario, adaptado a sufrir perturbaciones severas en la parte aérea, almacena sus reservas en el tejido menos expuesto a sufrir daños.

Figura 5. Valores medios del porcentaje de peso de almidón con respecto al peso seco total de floema y raiz. Los cinco momentos de muestreo se corresponden a 1) momento inicial previo al tratamiento, 2) Los arboles tratados presentan yemas epicórmicas engrosadas, 3) los rebrotes han elongado y se ha recuperado parte de la actividad fotosintética, 4) los árboles tratados recuperan el crecimiento en grosor 5) en la primavera siguiente.

Los valores de isótopos estables de carbono en los diferentes tejidos muestran un cambio a partir del primer muestreo tras los tratamientos (Figura 6). Las nuevas acículas surgidas a partir de los rebrotes son de morfología juvenil (inserción aislada), y parecen generar unos fotosintatos con un δ13C menor que el de las acículas de morfología adulta (braquiblasto) de los árboles control. Esto genera que los exudados del floema e incluso la fracción soluble en agua de las raíces presenten también la influencia de estos fotosintatos, al tener estas muestras menor contenido de 13C. También se puede apreciar que la nueva biomasa foliar está generada con unos carbohidratos de menor contenido en 13C, y por lo tanto es producida principalmente por nuevos fotoasimilados, y no por las reservas almacenadas en las raíces, que tienen un mayor δ13C.

Figura 6. Valores medios de δ13C por grupo en los distintos tejidos muestreados (acículas completas y su fracción soluble en agua, exudados de floema, raíces completas y su fracción soluble en agua). Las barras verticales indican la desviación típica.

Esta menor cantidad de 13C en los fotoasimilados provenientes de los rebrotes encaja con las mediciones de intercambio gaseoso tomadas tras los tratamientos, observando como en todos los grupos, a pesar de tener distinto tipo de acículas, la tasa fotosintética es similar (Figura 7). Sin embargo, existe una mayor conductancia estomática en las acículas de inserción aislada presentes únicamente en los árboles tratados, lo que genera una mayor concentración intercelular de CO2 en relación con su concentración ambiental. Por lo tanto, se genera una mayor cantidad de CO2 de la que puede aprovechar la hoja de inserción aislada, no viéndose incrementada su tasa fotosintética, y favoreciendo una mayor discriminación frente al 13C, dando lugar a δ13C más. Esto implica también un mayor consumo de agua por unidad de carbohidratos producidos, suponiendo una menor eficiencia en el uso del agua por parte de los rebrotes.

Figura 7. Valores medios de la conductancia estomática y la tasa fotosintética, tomadas en distintos momentos de la recuperación. Las barras verticales indican la desviación típica.

EXPRESIÓN GÉNICA

Hemos realizado un análisis transcriptómico de la formación de la madera traumática, midiendo la expresión genética en tres momentos del proceso de cicatrización: H1 tras 1 semana, H2 tras 11 semanas, y H3 tras 13 semanas a partir de la realización de la herida. Se han comparado los perfiles de expresión observados con los obtenidos durante el proceso de xilogénesis constitutiva, que ha dado como resultado el ensamblaje de un transcriptoma de novo durante el crecimiento vegetativo a partir del cambium vascular. Este transcriptoma incluye 44849 contigs y 103764 singletons, totalizando más de 25 Mpb, y tras su anotación con las bases de datos disponibles se obtuvieron los mejores resultados frente a Pinus pinaster, alineándose el 92.66% de las secuencias.

Figura 8 Genes diferencialmente expresados (DEGs) en el proceso de cicatrización. H1: una semana tras la ejecución de las heridas (abril). H2: 11 semanas tras la ejecución de las heridas (junio). H3: 13 semanas tras la ejecución de las heridas (julio).

Durante el crecimiento estacional (de marzo a septiembre), hemos comprobado que la mayor parte de los genes que presentan variación en sus niveles de transcripción (DEGs, differentially expressed genes) se pueden agrupar en dos patrones de expresión principales. La mayor parte de estos DEGs presentan un incremento en sus niveles de transcritos durante los meses primaverales, coincidiendo con la mayor tasa de división del cambium vascular, seguido por un marcado descenso durante los meses de verano y en muchos casos un ligero repunte al inicio del otoño. Otro importante grupo de DEGs presenta un patrón opuesto, alcanzando la mayor acumulación de transcritos durante el verano. Estos patrones se corresponden con las pautas de crecimiento del meristema lateral, con un máximo primaveral, una parada o al menos una marcada reducción en la tasa de división durante el verano, y una nueva reactivación durante el otoño. Este patrón es característico de los ambientes mediterráneos, donde se ha descrito el policiclismo frecuente en especies como Pinus pinaster o Pinus halepensis. Estos resultados han sido publicados en una revista científica perteneciente a la categoría forestal:

– Chano V, López de Heredia U, Collada C, Soto A (2017). Transcriptomic analysis of juvenile wood formation during the growing season in Pinus canariensis, Holzforschung (in press)

Figura 9. Agrupamiento de los genes diferencialmente expresados (DEGs) en 12 clústeres en función de su patrón de expresión durante la cicatrización. El color verde indica sobreexpresión, mientras que el rojo indica represión, en comparación con la formación de madera no traumática.

Además, hemos identificado 1408 DEGs durante el proceso de respuesta a un traumatismo y durante la formación de xilema traumático. La respuesta inmediata H1 incluye 837 DEGs, el grupo más numeroso, mientras que el menos numeroso fue la respuesta intermedia H2 con 336 DEGs. H3 incluyó 619 DEGs. 69 DEGs mostraron una expresión alterada durante los 3 tiempos estudiados. Del mismo modo, solamente 44 DEGs fueron comunes para H1 y H2, y 66 para H1 y H3, mientras que 136 coincidieron para H2 y H3 (Figura 8). El patrón de expresión de estos 1408 DEGs se agrupó en 12 clústeres o grupos de expresión (Figura 9), y de manera general, se identificaron grupos de genes fuertemente inducidos de manera inmediata, mientras que otros genes inicialmente reprimidos en H1, recuperaron sus niveles normales o incluso fueron sobreexpresados en H2 y H3. Entre los genes inducidos en H1 destaca la presencia de aquellos relacionados con respuestas frente a estrés oxidativo y estrategias defensivas que implican enzimas hidrolíticas, a la vez que se observa la represión de genes implicados en la formación de madera temprana en esta fase. Por el contrario, durante las fases H2 y H3 se observa la sobreexpresión de genes relacionados con la formación de la pared celular en la madera temprana, lo que indica que determinados genes implicados en la formación de la matriz de celulosas y hemicelulosas de la pared en la madera temprana son también sobreexpresados durante la formación de la madera traumática, mientras que otros genes implicados en el mismo proceso en la madera tardía se ven reprimidos (Figura 10). La alteración en la expresión de estos genes posiblemente contribuya a los cambios en los rasgos anatómicos y estructurales observados en la madera traumática.

En la respuesta a la herida se pueden distinguir dos fases: de manera inmediata, se interrumpe el proceso de xilogénesis en las regiones cercanas a la herida, donde se sobreexpresan genes de defensa, ante la eventual entrada de patógenos; a continuación, se inicia la formación de madera traumática. Esta madera carece de traqueidas con paredes secundarias engrosadas y fuertemente lignificadas; por el contrario, comparte patrones de expresión genética y características anatómicas con la madera temprana. Estos resultados sugieren que el árbol prima el rápido cierre de la herida con una madera quizá menos eficiente pero metabólicamente menos costosa.

Figura 10. Arriba: Sobreexpresión durante el proceso de cicatrización de genes característicos de madera temprana (izquierda) o tardía (derecha). Abajo: Represión durante el proceso de cicatrización de genes característicos de madera temprana (izquierda) o tardía (derecha).

A partir de estos resultados se está terminando la redacción de un artículo científico que será publicado en una revista de alto impacto. Además, se ha publicado una revisión sobre la metodología utilizada en estudios de estas características en especies forestales:

– López de Heredia U, Vázquez-Poletti JL (2016). RNA-seq analysis in forest tree species: bioinformatic problems and solutions. Tree Genetics and Genomes 12:30. doi: 10.1007/s11295-016-0995-x

ESTADO HÍDRICO Y FUNCIONALIDAD DE ACÍCULA, TALLO Y RAÍZ

Desde el punto de vista fisiológico, se ha comprobado que el anillado completo del tronco, sobre plantas de tres savias, provoca una disminución inmediata en la conductividad hidráulica de la raíz, lo que puede contribuir a explicar el descenso de la transpiración observado a los pocos días de aplicar el tratamiento. Las plantas respondieron al anillado con profusión de brotes epicórmicos bajo la herida. Estos brotes se eliminaron, anulando toda posibilidad de transporte de fotosintatos a las raíces. En estas condiciones, solo sobrevivieron las plantas capaces de lograr la reconexión floemática a partir del callo que se formó en la parte alta de la herida, aunque algunas plantas lograron sobrevivir sin reconexión hasta más de 140 dias, presumiblemente a costa de las reservas almacenadas en el xilema.

Estos resultados han dado lugar a dos publicaciones en una revista científica de alto impacto:

– López R, Brossa R, Gil L, Pita P (2015). Stem girdling evidences a trade-off between cambial activity and sprouting and dramatically reduces plant transpiration due to feedback inhibition of photosynthesis and hormone signaling. Frontiers in Plant Sciences 6:285. doi: 10.3389/fpls.2015.00285

López R, Cano FJ, Choat B, Cocherd H, Gil L (2016). Plasticity in vulnerability to cavitation of Pinus canariensis occurs only on the driest end of an aridity gradient. Frontiers in Plant Sciences 7:769. doi: 10.3389/fpls.2016.00769

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